重現性差代表液相色譜故障了？

            重現性差代表液相色譜故障了？

    重現性差是液相色譜分析中出現故障的一個準確信號，首先在分析那些滿足系統適配性的樣品時出現的問題，分析工作者使用這些樣品測定時，液相色譜方法及其系統能否很好的工作？其次，測得的峰面積值變化范圍與通常觀察到的測量誤差比較起來是否相差很大？

    重現性差是液相色譜分析中出現故障的一個準確信號，首先在分析那些滿足系統適配性的樣品時出現的問題，分析工作者使用這些樣品測定時，液相色譜方法及其系統能否很好的工作？其次，測得的峰面積值變化范圍與通常觀察到的測量誤差比較起來是否相差很大？

zui后，當空白樣品基體與已知樣品進行比較表現出不同時如何判別？都是需要解決的問題！

           系統適配性分析試驗中的奇怪的譜圖

 問題

用我的方法進行系統適配性樣品性能試驗時遇到了費解的問題。 我分析測定了儲存于不同強制條件下樣品的穩定性。我將所有的標準品都制成同一溶液并立即冷凍在--78℃溫度下 。每隔一段時間取出 3小瓶做系統適配性分析試驗，取另一小瓶作為校準標樣.每一小瓶中都配有一個分析物和一個內標物。

系統適配性試驗需要從每個系統適配性標樣小瓶中取出一份，進行3次進樣。該法要求保留時間的重現性以及分析物與內標物峰面積比值（ 響應因子）的相對標準偏差（RSD）在一定的范圍之內。

我用該法在zui后兩次測定時發現了奇怪的色譜圖形。 在所有情況下， 前兩個小瓶進樣的響應值相同，但第3個小瓶進樣的峰面積明顯變小。在每個小瓶中， 峰面積是恒定的， 所有進樣的保留時間是相同的，而且響應因子的 RSD是良好的 。這個分析是滿足系統適配性要求的， 后來對強制樣品的分析也都得出所期待的結果。 *奇怪的問題是，系統適配性

進樣的第 3 個小瓶的峰面積響應出現階躍變化，這是怎樣產生的？

 解答

峰面積之所以下降，是由兩個原因之一引起的——或者進樣體積減小，或者樣品濃度變低。 可利用內標來補償進樣體積的變化或預處理時的樣品損失。內標正確地補償了這些變化，得出的結果就能令人滿意。

首先，讓我們再做幾次試驗以考察與標樣有關的潛在問題，例如， 究竟是3號小瓶的內容物有問題， 還是它所處的位置或進樣順序有問題。若仍有標樣，應按第1次3個小瓶的順序重新進樣，并觀察是否出現相同的現象。 然后重新安排這 3個小瓶的進樣順序（ 例如改成 2號、 3號、1號的順序），觀察究竟是小瓶內容物還是進樣順序引起了峰響應的改變。

若因稀釋錯誤使 3 號小瓶內所裝的分析物和內標物濃度變低， 則峰面積應該下降，但響應因子應該相同。 濃度低的可能性很小， 因為所有小瓶中的樣品都是在同一時間制備并儲存在相同條件下的。重新檢查這些系統適配性標樣的制備過程，可能會揭示出問題的根源。

若低響應是由小瓶的位置而不是由于裝瓶時樣品濃度不同所致，則問題的出現可能是由自動進樣器或色譜柱的填充狀況變化造成的。這種可能性可以通過第 3次進樣后將前兩個小瓶中的樣品重新進樣來檢查。若響應仍然很低，應該考慮邏輯線路方面的問題。若響應回到正常值，就將第3個小瓶樣品再重新進樣一次。

根據我的經驗，系統填充情況的變化不是像你觀察到的階躍變化， 而是一個漸變的過程。 例如，由于在柱內硅醇基與堿性官能團之間的相互作用使分析物的峰產生嚴重拖尾。有時在正常濃度或高濃度情況下 ，進幾次標樣能使硅醇基失活， 并可改善下幾次進樣的峰形 。同樣，若系統中某一部位還在吸附樣品，就必須在獲得正常響應之前進幾次樣 ? 使活性部

位飽和。無論如何，在這種情況下，流出圖上的峰面積是逐漸增大而不是逐步減小的，因此我并不認為這種解釋是適合于現有問題的。

我猜想自動進樣器的第 3個位置可能出了毛病。如果發生了這種情況，以后的工作就應該避開那個位置。同時也要仔細檢查控制程序， 以確保對第 3個小瓶的較少進樣不給出指令。這兩個問題也可以通過使用其它方法用另一個標樣來檢查，例如，在標準條件下使用色譜柱試驗樣品進行測試，就能排除任何與方法有關的化學問題，而把問題集中在機械或電子學方面。

在這里，沒有給出任何明確的答案。通過仔細研究，尋找峰面積響應趨勢的數據，尤其是分析物和內標物的數據， 就有可能發現問題。

峰面積的重現性很差

問題

用我的方法給出的峰面積的重現性很差。 保留時間很好，但峰面積的 RSD 已達 5%~10%，可我常見到的只有 1%~2%。 我在這個與出現問題有關的系統中什么都沒有改動。這個系統由一個低壓混合系統 、一個自動進樣器、一個C8色譜柱和一個UV 檢測器組成。等度洗脫的流動相在線混合，流動相為PH3 的磷酸緩沖液和甲醇。

解答

峰面積的重現性依賴于自動進樣器操作的一致性。所以我認為這就是你的問題的根源。首先，應盡量保持進樣的始終如一。 通過進已知標樣的相同樣品zui容易查出主要原因，問題可能就出在樣品瓶上。

樣品必須是均勻的。高鹽濃度的樣品基體容易分層，冷凍時會混合不勻 。萬一有分層存在， 就要來回搖動樣品瓶? 使瓶中內容物混合均勻。樣品瓶太滿、 密封太緊可以產生不同的結果。

吸樣時， 樣品瓶中形成一定真空，造成吸樣困難。這種條件就造成了進樣量的差異。通常瓶中內容物不超過總容積的 1/2~3/4為*。

如果樣品溶劑容易揮發， 那么樣品瓶密封不良也能出現問題。 樣品溶劑的蒸發損失可以導致每次進樣的樣品濃度不同。

滯留在自動進樣器針頭里的樣品瓶隔膜小片移動時， 能起到開合的擋板作用 。這種情況可產生不良的重現性， 或者地說， *不能進樣。 懷疑阻塞時可以沖洗進樣管和進樣針頭， 用針頭捅絲清除異物，或者更換新針頭。 使用不能被針頭穿切出小片的硅橡膠樣品瓶隔膜。 貼面的隔膜似乎比別的材料更不容易被穿切出小片。

不適當地使用注射器和取樣裝置更容易出現重現性問題 。 例如，在我的實驗室中把一些自動進樣器設計成通過很長細內徑的塑料管把樣品從樣品瓶轉移到進樣閥中，如果這個輸送管中有氣泡， 它們遇到阻力變化時會膨脹或收縮， 導致從樣品瓶中吸取樣品量的變化。 為了防止這一情況發生， 分析工作者在使用前應將溶劑*脫氣并清洗進樣管。有些自動進樣器的設計是根據所要求的進樣體積而使用不同規格的注射器 。

若注射器與樣品量失配， 動作位置的失誤會導致嚴重的誤差， 因此要注意檢查安裝的注射器是否適當。若設計的自動進樣器是從樣品瓶吸取樣品再傳送到進樣閥， 則問題可能出在進樣閥上。 樣品針頭在進樣口處必須密封良好， 否則樣品會泄露損失。 應該調整或更換進樣針頭的密封圈以防泄漏 。

流路上的任何阻力都能產生反壓， 造成進樣針頭周圍泄漏。 應檢查進樣閥的每條通路， 尤其要保證廢液導管暢通。否則， 樣品溶液和緩沖液的蒸發會留下殘渣， 逐漸堵塞廢液導管。對進樣閥組裝不正也能產生反壓， 使樣品針頭的密封圈泄漏。進樣方式能影響峰面積的重現性，但自動進樣要好于手動進樣。 由于流體流動的特性，在定量管全充滿情況下，當樣品量至少為定量管體積的二三倍時，會產生精度的zui高等級；而在定量管半充滿情況下， 當樣品量少于定量管體積的一半時， 精度zui高。 由于這個原因，你應該從兩個方面來檢查， 即不僅要檢查是否把合適的定量管安裝在自動進樣器上， 而且還要檢查進樣體積是否與所要求的精度等級相一致。

泄露也能影響峰面積精度，但泄露產生的問題與保留時間變小相似，因此這個情況不大可能成為你的問題的根源。這樣，你可以領悟到進樣精度問題有很多可能的原因。 我一開始就想仔細考察所有系統的設置，以保證你不出現誤差，然后全面考慮上面列舉的全部可能性， 看它們當中是否有一個是問題的主要原因。

一次只改變一種可能性， 你就會找出問題的真正根源 。這個方法能幫助你懂得今后怎樣避免出現相同的問題。

進一個基體空白樣品時會遇到的高壓問題

問題

有時， 用我建立的一個液相色譜方法進一個基體空白樣品時會遇到很高的壓力 ，甚至自動停泵。 問題出在自動進樣器上，因為如果卸下進樣器出口管的連接接頭， 壓力是高的； 但斷開從泵到進樣器的給料管時，壓力則正常。 通常，壓力在幾分鐘內就能降至正常。 流動相是乙腈和 pH7的緩沖液 。 樣品是高鹽基體中的生物分子,樣品在其制備期間被脫鹽 。 是基體空白樣中的鹽引起這個問題嗎 ?

解答

你觀察到的壓力增大很可能是由系統中鹽的沉淀引起的。 應該知道鹽的濃度和流動相的確切組成。當乙腈同鹽和緩沖液混合時，溶解度很差是大家熟知的，例如，實驗室分析工作者發現，水相含有25mmol/L  以上磷酸鹽時, 乙腈濃度約大于80%就無法操作梯度系統了。有時，緩沖液與乙腈在主體溶液中混合不出現問題 ,但在線混合卻有了溶解度問題，因為出現在混合界面的沉淀會使管道或濾片堵塞。

為了解決這個問題，采用兩種方法之一；或者在進樣前稀釋樣品基體 ，或者通過相同的步驟凈化樣品 。 若一定要進等量的樣品基體， 就要把稀釋倍數和進更大的樣品體積結合起來， 例如，稀釋基體4倍， 進樣4次同量的基體。

還可以選擇甲醇作為流動相中的有機溶劑。 鹽和緩沖液在甲醇中比在乙腈中有更好的溶解度。 當然， 甲醇也許不能為你的方法提供所需要的色譜選擇性， 因此使用這種溶劑也可能并不奏效。分析工作者應避免使用容易使液相色譜中的樣品和緩沖液出現沉淀的各種條件。 電壓升高或出現堵塞，充其量把系統沖洗一下即可解決， 但若在色譜柱中出現了沉淀， 你就應該更換色譜柱， 因為這種沉淀不大可能再被溶解除去。

小結

將所有變量保持恒定時， 用液相色譜方法對同一化合物的重復進樣應得出相同的結果。每次進樣在峰面積、保留時間或其它所測參數上的偏差大于正常系統誤差時， 顯然是一個或多個變量控制不當的確切標志。 本文系統地、一步一步地將問題孤立了出來并給出了合乎邏輯的校正方法。